Descrizione del Progetto

Il presente progetto di ricerca, dal carattere fortemente traslazionale, si propone di identificare e validare nuovi bersagli terapeutici presenti nel microambiente tumorale immunitario (TIME) e responsabili della progressione tumorale e della resistenza agli attuali approcci di immunoterapia con inibitori dei checkpoint immunitari.
A tal fine vengono utilizzate moderne tecnologie omiche unitamente ad approfondite analisi bioinformatiche per una caratterizzazione del TIME di pazienti affetti da adenocarcinoma del polmone (LUAD).
La raccolta ed il processamento di versamenti pleurici maligni (MPEs) è finalizzata a ricreare sistemi ex vivo quanto più possibile vicini ai tumori dei pazienti.
Il team interdisciplinare coinvolto nell'esecuzione del progetto è costituito da 4 Unità Operative (U.O.) composte da oncologi medici, patologi, biologi, immunologi operanti presso due diverse istituti che sono il Dipartimento di Medicina Clinica e Molecolare (DMCM) di Sapienza Università di Roma e l’IRCCS Istituto Nazionale Tumori Regina Elena (IRE).
Le U.O. guidate dalla prof.ssa Rita Mancini e dal prof. Paolo Marchetti presso il DMCM e quelle guidate dal dott. Maurizio Fanciulli e dalla dott.ssa Paola Nisticò presso l’IRE hanno lavorato in maniera sinergica per la realizzazione del programma sperimentale articolato in tre principali attività:

1. Espansione di una biobanca ottenuta da MPEs di pazienti LUAD
2. Identificazione di bersagli terapeutici del microambiente immunitario
3. Validazione dei bersagli in modelli ex vivo mediante saggi immuno-funzionali

• Task1 (mesi 1-18). Relativamente al primo task del progetto, il lavoro svolto dalle UO dirette dal Prof. Marchetti e dalla Prof.ssa Mancini è risultato nell’arruolamento di 20 nuovi pazienti con diagnosi di LUAD complicata da MPEs. I campioni di MPEs e di sangue raccolti sono stati processati ed adeguatamente conservati ed in parte utilizzati per gli scopi specifici di questo progetto. Questo ha permesso di ampliare la collezione di campioni già presente e di ottenere 4 nuove linee tumorali attivamente proliferanti, con un tasso di successo del 20% come stimato in fase di stesura progettuale. Il materiale raccolto è stato funzionale allo sviluppo delle attività previste per i task 2 e 3 del progetto.
• Task2 (mesi 4-20). Il secondo task2 del progetto prevedeva l’utilizzo di moderne tecnologie per effettuare una caratterizzazione su larga scala del panorama delle cellule immunitarie e del loro stato di attivazione nel microambiente tumorale delle MPEs. Grazie al lavoro coordinato della UO diretta dal Dott. Fanciulli e dell’unità di bioinformatica dell’IRE, durante i primi 8 mesi previsti si è proceduto con il sequenziamento totale dell’RNA (RNA Seq) estratto da PEMC e PBMC di 5 pazienti LUAD e 4 donatori sani. Inoltre, i campioni di nove pazienti aggiuntivi sono stati utilizzati per la validazione, tramite Real time PCR dei dati ottenuti tramite RNA Seq. Tutti i dati grezzi ottenuti e le relative analisi bioinformatiche sono stati depositati online, con accesso libero, al seguente link https://gitlab.com/bioinfo-ire-release/bruschini_pallocca_etal. Inoltre, come previsto da progetto, l’UO coordinata dalla Dott.ssa Nisticò ha proceduto con l’analisi ad ampio spettro dei fattori solubili rilasciati nel microambiente delle MPEs e che mediano l’attivazione o l’inattivazione, nonché il reclutamento di cellule immunitarie nel sito tumorale. L’analisi è stata effettuata sulle MPEs e sul plasma di 15 pazienti LUAD e 4 donatori sani, come controllo. Le analisi a singola cellula effettuate su dati di scRNA Seq ottenuti dalle MPEs di pazienti LUAD hanno permesso di analizzare con una maggior risoluzione il compartimento dei macrofagi presenti nelle MPEs e di individuare nello SCGFβ, il fattore solubile più rappresentato nelle MPEs, un possibile attore chiave nel mediare un cross talk tra fibroblasti e cellule immunitarie all’interno dei versamenti pleurici, almeno in parte responsabile dell’instaurarsi di un ambiente pro-tumorale ed immunosoppressivo.
• Task3 (mesi 6-24). Relativamente al terzo ed ultimo task del progetto, il lavoro svolto si è avvalso delle competenze delle UO dirette della Prof.ssa Mancini e della Dr.ssa Nisticò, nel campo della messa in coltura di cellule primarie e di cellule immunitarie. Come riportato infatti nella sezione precedente (figure 8 e 9), è stato possibile mettere a punto saggi funzionali in vitro per valutare la capacità delle MPEs di indurre polarizzazione dei macrofagi verso un fenotipo M1/M2, nonché la capacità di stimolare la migrazione di cellule tumorali primarie isolate dalle MPEs degli stessi pazienti. Grazie all’esperienza della UO diretta dalla Dr.ssa Nisticò nel campo dell’isolamento e messa in coltura di CAFs e della UO della Dr.ssa Mancini nell’isolamento di linee tumorali primarie derivanti da MPEs (task1 del presente progetto) è stato inoltre possibile validare l’espressione di uno dei fattori solubili risultato più interessante, grazie all’integrazione delle analisi bioinformatiche e dei risultati sperimentali (attività svolta durante tutto il secondo anno di progetto), su linee cellulari (sia del microambiente che tumorali) derivate direttamente da pazienti LUAD.

Scopo

L'obiettivo del progetto è convalidare potenziali nuovi bersagli utilizzando tecniche di silenziamento genico o anticorpi monoclonali commerciali specifici per i bersagli identificati. È però noto che questi ultimi non sono generalmente i migliori reagenti dal punto di vista terapeutico perché si tratta di monoclonali di origine murina che non possono essere utilizzati a fini clinici. Pertanto è necessario o generare anticorpi murini e poi sottoporli ai processi di umanizzazione, oppure generare anticorpi umani direttamente o attraverso l'uso di topi transgenici umanizzati per immunoglobuline umane o librerie di fagi.
In questo contesto sia le aziende multinazionali che anche le Biotech del settore biofarmaceutico hanno un’esperienza adeguata per perseguire questa strada.
Questo progetto è prezioso perché rappresenta la sinergia tra i laboratori di ricerca, con lo sviluppo di modelli organoidi generati direttamente dai pazienti, e le aziende che producono anticorpi umani o umanizzati con i loro anticorpi monoclonali, all'interno del Distretto Tecnologico delle Bioscienze del Lazio (DTB).
I bersagli terapeutici individuati e sviluppati nel corso del progetto saranno sottoposti a percorsi di tutela brevettuale attraverso i Technology Transfer Offices (TTO) degli istituti partecipanti, dove sarà predisposto un piano di diffusione e valorizzazione delle potenziali ricadute cliniche e di mercato in caso di sviluppo industriale.

Risultati

La realizzazione del progetto ha permesso il raggiungimento dei seguenti obiettivi intermedi/finali:

1. Ampliamento della biobanca con 20 casi aggiuntivi di pazienti LUAD e 4 linee tumorali derivanti da MPEs, attivamente proliferanti
2. Generazione e deposito di dati grezzi (https://gitlab.com/bioinfo-ire-release/bruschini_pallocca_etal.) derivanti dalle analisi di RNA Seq
3. Messa a punto di saggi funzionali in vitro su cellule immunitarie e tumorali derivanti da pazienti
4. Individuazione di un potenziale bersaglio terapeutico espresso da cellule del microambiente tumorale, validato in campioni derivanti da pazienti.

Sostegno finanziario

Il costo totale del progetto ammesso a sovvenzione, sulla cui spesa Lazio Innova ha concesso un finanziamento massimo a fondo perduto del 100%, è di Euro 149.999,85.
Le risorse del finanziamento provengono dall’avviso pubblico "Gruppi di Ricerca 2020 POR FESR LAZIO 2014-2020” Determinazione G08487 del 19/07/2020 (BURL n. 93 del 23/07/2020 modificato con Determinazione n. G10624/2020 – BURL n. 116 del 22/09/2020) CUP B85F21001300002. 
Il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR) mira a consolidare la coesione economica e sociale nell’Unione europea correggendo gli squilibri tra le regioni. 
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